资料与方法
一、研究设计
由卫生部批准的5个临床药理基地组成研究组，进行多中心临床试验，分两个阶段进行。第一阶段为随机、双盲、安慰剂对照试验，病人分别服用拉米夫定或安慰剂，疗程12周。第二阶段为开放试验，病人全部服用拉米夫定，总疗程共3年。完成3年疗程后，在病人自愿的基础上，凡已获得HBeAg血清转换且稳定6个月以上者停药观察，未达血清转换再继续治疗2年，整个研究长达5年。本报告为3年研究的总结。本研究遵照卫生部和国家药品监督管理局(SDA)颁布的临床试验管理规范(GCP)进行。
二、病例选择
440例初筛通过，1例不愿接受治疗，439例服药后经复查，10例不符合试验要求，实际进入试验429例(不良反应以439例计算)。
1.入选标准：年龄16~65岁，筛选前血清HBsAg和HBeAg至少6个月或以上阳性，筛选时血清HBV DNA(斑点杂交法)，筛选前3个月内血清ALT在正常上限10倍以上。
2.排除标准：抗-HCV、抗-HDV和人类免疫缺陷病毒抗体(抗-HIV)阳性；失代偿性慢性肝病、自身免疫性肝病、遗传性肝病、骨髓抑制、肾功能异常[血清肌酐大于正常上限(ULN)1.5倍]、有严重器质性疾病、精神病、嗜酒、吸毒；筛选前6个月用过抗病毒药、免疫调节剂或抑制剂、细胞毒药物或类固醇激素；妊娠及哺乳期及有受孕可能而未采取有效避孕措施者；对核苷类药物过敏史者。
三、治疗方法及药物
按3:1的比例，统一随机分配到治疗组或安慰剂组。在12周内病人分别服用拉米夫定100mg/d或安慰剂1片/d，在13~156周所有病人均服用拉米夫定，100mg/d。拉米夫定和安慰剂由葛兰素威康公司免费提供。
四、观察项目
筛选及基础值测定：病史询问，体格检查，HBV标志，血清生化指标，血液学指标，育龄妇女加做尿妊娠试验。治疗期间的测定：在治疗开始后第2、4周及每隔4周进行上述检测和不良反应询问。从第2年开始，HBV血清学标志每3个月测1次，其他观察同上。血清HBV标志检测：治疗前的血清及第1年内治疗后各次血清，-40℃保存，送新加坡国立大学医院中心实验室用Abbott液相杂交法进行HBV DNA定量检测(Genostics assay)，用Abbott酶免疫试剂作HBeAg/抗-HBe和HBsAg/抗-HBs的检测。第2年起血清-40℃冻存由上海第二医科大学瑞金医院临床病毒研究室用bDNA(Beyer-Chiron)法定量测HBV DNA，以及HBeAg和抗-HBe(Abbott酶免疫荧光法)。HBV病毒变异的检测：血清送美国北卡罗来纳州葛兰素威康公司的病毒实验室，用PCR、内切酶片段长度多态性(RFLP)和测序法检测YMDD变异。灵敏度为500拷贝/ml。
五、疗效评估
主要指标：血清HBV DNA，HBeAg/抗-HBe；次要指标：血清ALT和临床表现。
六、安全性评价
记录治疗期间临床和实验室检查发生的一切不良事件，按WHO分级标准分成4级。
七、法规和伦理学事宜
本临床试验于1996年8月15日得到中华人民共和国卫生部批准，批文号(96)XL-51。本项研究计划于1996年10月28日得到上海医科大学医学伦理委员会的批准。每个病人均签署书面知情同意书。
八、数据处理
所有数据输入葛兰素威康公司数据中心处理、分析。病人的疗效分析根据意向治疗人群(ITT)原则，凡符合治疗标准并进入治疗的病人均进行分析。中途停药或脱落均按失效处理。凡实际服药治疗的病人，成为实际接受治疗病人人群，用于安全性分析。统计学方法：平均值用t检验，组间差异用卡方R×K法。
结 果
一、病人
入选429例病人，拉米夫定组322例，安慰剂/抗米夫定组107例。两组病人的人口学资料和治疗前疾病特征基本相同，可比性好。
二、疗效分析
1.血清HBV DNA：429例病人治疗前用斑点杂交法筛查HBV DNA均为阳性。用Abbott液相杂交法统一检测后，拉米夫定和安慰剂组HBV DNA＞1.6pg/ml的病人数为293例和99例，按此数字统计HBV DNA阴转情况。治疗第12周末，拉米夫定组HBV DNA水平降低大于90%，而安慰剂组的HBV DNA水平无明显改变。累计HBV DNA阴转率拉米夫定组显著高于安慰剂组(92.2%对14.1%，P＜0.01)。从第13周起所有病人均服用拉米夫定100mg/d。原安慰剂组病人服用拉米定夫后，HBV DNA水平迅速下降，在第24周时其降低水平与原来拉米夫定治疗组相同。第52周治疗结束时病人血清HBV DNA水平降低达90%左右，HBV DNA阴转率(＜1.6pg/ml)为72.7%(285/392)。从第2年起，血清HBV DNA定量用bDNA法，其灵敏度比液相杂交法高0.5~1 1n10。根据bDNA法测定结果，继续服用拉米夫定2年(共3年)，血清HBV DNA仍持续降低，表明HBV的复制继续被抑制，仅在病毒发生YMDD变异的病人中HBV DNA水平的中位值有轻度回升。
2.血清HBeAg/抗-HBe：429例在各中心筛查，均为HBeAg阳性，经新加坡国立大学医院实验复核400例阳性，按此数字统计。第1年治疗结束时血清HBeAg转阴率和HBeAg/抗-HBe血清转换率(伴HBV DNA转阴)分别为9.5% (38/400)和8.3%(33/400例)，第2年结束时HBeAg阴转率和HBeAg/抗-HBe血清转换率则分别为16.8%(67/400)和11.5%(46/400)。第3年结束时，HBeAg阴转率和血清转换率继续增高，分别为20.3%(81/400)和17.3%(69/400)，表明HBeAg阴转和血清转换率逐年增高，差异有显著性(P＜0.05)。HBeAg阴转和HBeAg/抗-HBe血清转换与治疗前ALT基础值和疗程有明显关系；在第3年治疗结束时，基础ALT＜1ULN、ALT＞1ULN、ALT＞2ULN和ALT＞5ULN各组病人，HBeAg阴转率分别为10.1%、31.1%、42.2%、66.7%(P＜0.01)， HBeAg/抗-HBe血清转换率分别为8.7%、26.3%、34.4%和61.1%(P＜0.01)。
3.血清ALT：在429例中有202例治疗前血清ALT高于正常，拉米夫定组和安慰剂组分别为151例和51例，于第12周结束时ALT的复常率分别为60.3%和27.5%，差异有显著性(P＜0.01)。此202例第1年、2年、3年结束时ALT持续复常率按ITT计数 ，分别为71.8%、50.5%和45.0%，第3年底如剔除缺失的病人，ALT复常率为58.8%(90/153例)。在治疗前ALT水平正常的227例病人中，第1年、第2年、和第3年结束时持续ALT正常分别为86.2%、54.5%和54.0%。剔除丢失数据，第2年第3年结束时83.0%(122/147)和79.1%(121/153)的病人ALT仍为正常。
4.临床症状：治疗3年后，病人临床症状有一定的改善。应用生活质量的评估，则可较为精确地了解病人的临床状态。根据初步研究，44例病人服用拉米夫定2年后，应用SF36的评分方式，其生活质量明显改善(P＜0.06)。
三、病毒变异
用PCR、RFLP和DNA测序技术对HBV DNA和YMDD变异进行检测，其灵敏度为500拷贝/ml。在第24周、48周、104周和168周HBV发生YMDD变异率分别为0%、12.1%、49.7%和70.5%。第48周、104周和第168周时血清HBV变异的检测结果见表1。
表1 治疗各时期HBV检测情况[例数 (率，%)]
治疗时间 例数 HBV DNA阴性(PCR) 野生株阳性 YMDD变异株阳性 第48周 396 36(9.1) 312(78.8) 48(12.1) 第104周 336 37(11.0) 132(39.3) 167(49.7) 第168周 278 21(7.6) 61(21.9) 196(70.5)1.病毒变异对血清HBV DNA的影响：大多数发生YMDD变异的病人，血清HBV DNA水平继续受到抑制，其血清HBV DNA 的中位数轻度升高，增至86mEq/ml(bDNA法)，相当于液相杂交法的10pg/ml，未变异组病人的血清HBV DNA中位值仍低于最低检测水平(1.6pg/ml)。
2.病毒变异对HBeAg/抗-HBe的影响：治疗后发生变异的病人，仍继续有HBeAg阴转和HBeAg/抗-HBe的血清转换，第3年仍有28例发生血清转换，但其出现率低于非变异组病人。非变异病人第1年、2年、3年的HBeAgb阴转率分别为21.3%(16/75)，37.3%(28/75)和42.7%(32/75)，变异病人则分别为7.6%(14/185)、15.7%(29/185)和20.0%(37/185), P＜0.05。非变异病人HBeAg/抗-HBe血清转换率在第1年、2年、3年分别为16.0%(12/75)，24.0%(18/75)和40.0%(30/75)；变异组病人则分别为5.9%(11/185)，9.7%(18/185)和15.1%(28/185),P＜0.01。
3.病毒变异对血清ALT的影响：发生YMDD变异病人ALT中的位数值在156周时仍在正常值上限以下，但范围变异较大，为(1~23.3)×ULN。57.9%(113/195)病人的ALT仍正常，26.2%(51/195)高于治疗前水平。在治疗过程中6.1%(17/277)病人病情一过性加重，ALT＞5ULN。变异组为5.1%(10/195)，其中6例(3.1%)≥10ULN，伴有胆红素升高。无变异组病人中8.5%(7/82)ALT＞5ULN，但无1例≥10ULN。这些病人经一般对症处理后临床和生化指标恢复或明显缓解。
四、安全性和不良反应
1.脱落和中途退出：本组共有439例服药，429例符合入选标准，10例中止继续治疗。429例中，304例(70.9%)完成了3年全程治疗，125例脱落。第1、2、3年脱落病例分别为37例、43例和45例。其中13例由于不良反应，11例由于无效而中途退出；31例由于出国、迁移、妊娠、拟怀孕、拒绝抽血和70例失访未完成全程治疗。
2.不良反应：第1、2、3年中出现1项或以上总的不良反应发生率分别为58.8%、66.1%和68.0%。其各项发生率≥5%者，列于表2，这些反应大多为轻度或中度，在治疗过程中自行缓解或消失。根据经治医师的评估，24.8%(109/439)的不良反应可能与治疗药物有关。3年内共有34例按FDA标准被评估为严重不良反应。其中16例与乙型肝炎无关，分别为急性阑尾炎3例(2例停药)，外伤性骨折2例(1例停药)，心肌梗死2例，淋巴瘤、异位妊娠、甲状腺瘤、传染性单核细胞增多症、甲型肝炎、直肠腺癌、胆囊息肉、高热、腹胀和乏力各1例，合计9例(后3例停药)。17例有肝功能异常，ALT≥5ULN，并伴有轻度至中度症状，6例ALT≥10ULN，伴高胆红素血症。其中10例有YMDD变异，7例停用拉米夫定，经用适当对症和抗炎治疗后，除1例ALT持续波动数月外，均缓解，ALT复常或接近正常，症状消失。经评估，除与YMDD变异有关外，有2例认为与药物治疗有关，余者为疾病过程中的波动或活动。有3例曾出现轻度生化指标失代偿表现，如轻度低白蛋白血症(＜30g/L)和凝血酶原时间延长(＞3s)。无一例出现肝性脑病、腹水和食管静脉曲张出血。
表2 439例病人拉米夫定治疗过程中出现的不良反应发生率(%)
不良反应
第1年
第2年
第3年
乏力
12.1
15.9
18.5
体温不正常
9.3
12.1
13.7
咳嗽
8.4
11.2
12.1
咽痛
8.4
11.2
12.1
上腹部不适/疼痛
10.0
10.9
12.3
咽炎、扁桃体炎
5.0
10.3
14.4
头痛
8.2
9.6
10.5
肝胆系统症状
7.7
10.5
11.4
腹泻
7.7
8.9
10.5
头晕
7.7
7.7
7.7
呼吸道病毒感染
7.7
7.7
8.0
恶心或呕吐
6.2
6.6
7.1
讨 论
拉米夫定治疗慢性乙型肝炎可使病人获病毒学、肝脏生化功能和肝组织学的改善，其主要作用机制是抑制HBV聚合酶，从而抑制HBV的增殖，使肝脏免受病毒的侵袭。但是拉米夫定不能消除肝细胞内HBV的共价闭合环状DNA(cccDNA)。在应用拉米夫定期间，病毒的复制受到抑制，血清内DNA明显降低，停用拉米夫定后，以cccDNA为模板，形成前基因RNA，又开始了HBV的复制过程。因此，从治疗策略上考虑，在目前的条件下，拉米夫定最好长期应用，使HBV的复制持续受到抑制，期望经过一定时期后，通过机体免疫应答和衰老肝细胞的凋亡，使肝细胞内HBV的cccDNA得以清除。但是长期应用拉米夫定能否维持持久的疗效？病毒出现YMDD变异对临床的影响？长期服药是否安全？病人能否耐受？这些问题均需通过长期系统的观察来答复。
根据本项研究，病人服用拉米夫定达3年以上，绝大多数病人继续取得疗效，表现在绝大多数病人的血清HBV DNA和ALT水平持续维持在低水平，部分病人出现HBeAg阴转和HBeAg/抗-HBe血清转换。特别是治疗前ALT≥2ULN时，在第3年时HBeAg阴转率和血清转换率分别为51%和40%。这与在香港、台湾和新加坡的研究结果基本一致。廖运范等报告治疗2年后，血清转换率为27%。梁慧仪等报告治疗3年后血清转换率40%，治疗前ALT基础值＞2ULN者，血清转换率可达65%。病人一旦出现血清转换后，如停用拉米夫定，其持续疗效如何？文献报道，拉米夫定治疗后病人一旦出现HBeAg/抗-HBe血清转换，继续服药6个月，其持久有效率可达80%左右。在出现血清转换后，再持续服药大于6个月者，疗效为90%，而不满6个月者疗效仅为20%。我们也有相似的观察，将在另文中做进一步报道。
应用核苷类药物治疗慢性乙型肝炎可能会导致病毒基因的变异。本组服用拉米夫定1年、2年和3年后YMDD变异的发生率分别为14.6%、49.7%和70.5%。病人出现了病毒的变异，拉米夫定仍能继续抑制大部分病人的血清HBV DNA，ALT维持正常，并伴有HBeAg阴转和血清转换，只有少数病人出现较明显的病情波动。在这种情况下，应根据具体情况权权衡用药的利弊。多数病人可继续治疗。这是因为拉米夫定的应用，可持续抑制HBV野生株的复制，而YMDD变异株的增殖能力和致病性一般较野生株低，一般情况下不会造成临床上的恶化。在少数情况，可谨慎地停药观察和给予支持疗法。总之，出现了YMDD的变异株，是否继续用药要根据临床情况加以判断。根据本研究组的初步观察，YMDD变异后出现的ALT和胆红毒增高，适当应用静滴甘草酸类制剂，有一定的效果。今后期望其他有效药物如恩替卡韦、阿德福韦等的联合应用。关于拉米夫定的长期安全性和耐受性，本研究进行了比较系统的观察，部分病人在治疗期间可产生呼吸道、消化道和神经系统等的症状，但一般较轻，可自行缓解，无需停药，这些不良反应并不一定与药物有关。在长达3年的治疗期，即使正常人也可能有上呼吸道感染、发热、腹部不适和头痛、头晕等症状，但仍需严密注意。本组仅400余例，样本还不够大，目前已完成了2200例的第IV期临床试验，其不良反应与本研究结果基本一样，已向药品监督管理局汇报，待审查后另文报告。
